¿Es posible silenciar un cromosoma 21 en el síndrome de Down?

Su objetivo es sensibilizar e informar sobre esta anomalía genética que afecta a uno de cada 700 niños nacidos vivos causante de una deficiencia intelectual acompañada de otras alteraciones funcionales, no especialmente graves, de los sistemas nervioso, cardiaco, digestivo e inmunológico.

En junio de 2011, la Fundación Síndrome de Down Madrid propuso la preciosa iniciativa de organizar la exposición al aire libre “más allá de un rostro”, que mostraba 132 fotografías de gran formato, auténticas obras de arte, de niños con síndrome de Down, acompañadas de frases que invitan a la reflexión: «Tengo un cromosoma más. Y tú, ¿qué tienes diferente?»; «Cuando llegué a casa, papá y mamá no sabían qué hacer conmigo. Ahora no sabrían qué hacer sin mí»; «Si tú quieres puedes. Si yo quiero puedo. Cuando queremos, entre todos podemos»; «Hacer a los demás mejor persona está al alcance de muy pocos. Sólo de los mejores»; «Es por ti que veo océanos, donde solo había charcos» …

Si hay algo que caracteriza a estas personas es que desde que nacen son felices y se ganan el cariño de sus padres y hermanos como lo testimonian las familias que los tienen o los acogen.

Todo lo que se haga para sensibilizar a la sociedad hacia la defensa de la vida y el bienestar de las personas con síndrome de Down es poco. Se trata de respetarlas y ayudar a sus familias a afrontar con éxito las dificultades relacionadas con su salud y su educación. Sin embargo, lo que no es una solución es ocultarlos, como se hacía antaño, o evitar su nacimiento mediante un aborto eugenésico tras un diagnóstico genético prenatal, como lamentablemente está ocurriendo hoy con inusitada frecuencia.

El médico y genetista francés Jérôme Lejeune (1926-1994), que descubrió la causa del síndrome de Down, la trisomía del cromosoma 21 (2n=47 +21) y que fue un gran defensor de los niños con esta alteración, participaba de la idea de que la vida es un don de Dios y que todo ser humano debe ser tratado con la misma dignidad, con independencia de su condición física o su salud. Con frecuencia decía que el enemigo del médico no es el enfermo, sino la enfermedad. El mismo Lejeune mantuvo la ilusión de que su descubrimiento sirviese como piedra angular para tratar de solucionar los problemas médicos que conlleva.

En este sentido es de señalar la gran labor que viene desarrollando la Fundación Jérôme Lejeune, impulsada por el propio genetista francés y desarrollada tras su fallecimiento en 1995 por su esposa Birthe Lejeune (1928-2020). La Fundación, con sede en París, dedica entre 4 y 5 millones de euros anuales a la investigación, dispone de un biobanco en París con más de 20.000 muestras, otro a punto de abrirse en Madrid y cuenta ya con cuatro centros médicos. El primero en París –por donde han pasado más de 13.000 pacientes-, y otros tres, en Nantes (Francia), Madrid y Córdoba (Argentina).

La investigación para evitar los efectos del tercer cromosoma 21

Aparte de los cuidados clínicos y la promoción de la educación especial que requieren las personas con síndrome de Down, es necesario investigar sobre sus causas.

No es un problema fácil, pues en su origen no hay un gen o unos pocos genes implicados, sino nada menos que los 300 a 400 del cromosoma 21, de los cerca de 21.000 genes codificantes de proteínas que contiene el genoma humano completo. Nuestro genoma contiene 23 pares de cromosomas (2n = 46; 22”+XX o 22”+XY). El cromosoma 21 es el de menor contenido genético del genoma, pues, aunque el cromosoma 22 es más pequeño, su número de genes alcanza los 800. Eso explica que una aneuploidía por exceso, como la trisomía 21, sea mejor tolerada, tenga menos efectos fenotípicos y de lugar a menos abortos espontáneos que las trisomías de cualquier otro cromosoma, incluidas las del 13, con 800 genes, causante del síndrome de Patau, o la del 18, con 600 genes, causante del síndrome de Edwads.

Es evidente que detrás de los cuadros patológicos causados por estas trisomías, que son las únicas parcialmente viables, hay un problema de sobreexpresión de los genes triplicados que encierran. Para paliar sus efectos habría que silenciar o bloquear la expresión de los genes contenidos en uno de los tres cromosomas, sin afectar la actividad de los contenidos en los otros dos de la dotación normal.

Una primera aproximación al problema sería moderar la expresión de aquellos genes contenidos en el cromosoma extra que se supiera tienen una mayor incidencia en el fenotipo alterado. Pero, en este caso, la cuestión estriba en determinar cuáles son esos genes importantes, para una vez conocidos, tratar de aplicar alguna tecnología que permitiera su silenciamiento. Veremos a continuación varias iniciativas de este modo de atacar el problema por diversos grupos de investigación.

El gen y la proteína DYRK1A

Según una investigación dirigida por la Dra. Mara Dierssen del Centro de Regulación Genómica (CRG) del Instituto de Ciencia y Tecnología de Barcelona, el exceso de la proteína DYRK1A, que produce el gen del mismo nombre con sede en el cromosoma 21, provoca una malformación de las terminaciones neuronales similar a la que padecen las personas con Síndrome de Down. Los experimentos realizados con ratones transgénicos a los que se ha incorporado el citado gen, demuestran la relación entre la sobreproducción de la proteína DYRK1A, la arquitectura de las neuronas y la función cerebral relacionada son los trastornos cognitivos que se observan en el Síndrome de Down_[1]. Pero esta proteína no es la única responsable. En trabajos posteriores del mismo grupo en modelos animales, se subraya que esta es sin duda una línea de investigación interesante, que permitirá conocer más genes implicados en el síndrome de Down. A partir de ahí habrá que buscar la forma de moderar o silenciar sus efectos.

Disfunción de dominios de la expresión génica (GEDD)

Otra estrategia es el estudio comparado en gemelos monocigóticos, de los que uno tiene el síndrome de Down (2n=47+21) y el otro no (2n=46). Un equipo dirigido por el Dr. Antonarakis del Departamento de Genetica Médica y Desarrollo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ginebra, descubrió diferencias de expresión en territorios génicos determinados al comparar las expresiones del genoma entre los gemelos idénticos. A este efecto se le denominó «disfunción de dominios de la expresión génica» (GEDD). Los investigadores encontraron 182 genes que variaron en los niveles de expresión entre los gemelos idénticos, a diferencia de lo que ocurre en los gemelos dicigóticos o no idénticos. Es decir, la trisomía provoca una perturbación de la regulación génica que puede afectar al resto del genoma. Los autores concluyeron que la adición de una pequeña parte del genoma de unos 30 megabases (1% ciento de un genoma de 3.100 millones de pb), puede perturbar todo el transcriptoma. Los resultados demuestran la complejidad del problema que se relaciona con un desequilibrio en la interacción intergénica causada por la trisomía de uno de los cromosomas 21 _[2].

Silenciar el cromosoma 21 sobrante incorporándole el gen Xist en el locus Dyrk1a

Según lo anterior, una alternativa de abordaje del problema sería la anulación completa del cromosoma extra, sin alterar la expresión de los genes de los dos cromosomas restantes.

Un grupo de investigación del Departamento de Biología Celular y Desarrollo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, trató de silenciar el cromosoma 21 extra, mediante la aplicación de un modelo para estudiar la inactivación de los cromosomas humanos basado en el fenómeno de la “lionización”, por el que de forma natural se inactiva uno de los dos cromosomas X en las hembras de mamífero en las primeras divisiones celulares del desarrollo embrionario. Dado que el factor que provoca esa inactivación es el gen Xist, los investigadores diseñaron un experimento de transgénesis in vitro para incorporar el citado gen Xist en el locus Dyrk1a del cromosoma 21 en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) procedentes de fibroblastos de un paciente con síndrome de Down. El resultado fue que el ARN no codificante transcrito por Xist desencadenaba la metilación del ADN y como consecuencia la compactación de todo el cromosoma 21 hasta formar un «cuerpo de Barr 21», conduciendo a su silenciamiento transcripcional. Tras la aplicación de Xist en las iPSC, se rescataron varios clones celulares que presentaban de uno a los tres cromosomas 21 modificados.

Como consecuencia, al menos in vitro se consigue eliminar la expresión de al menos uno de los tres cromosomas 21 implicados en la trisomía 21, lo que supone un paso importante hacia la consecución de una futura aplicación clínica para el logro de una terapia cromosómica_[3]. Quedaban todavía muchos problemas por resolver, como reducir el silenciamiento a solo uno de los tres cromosomas 21, o trasladar el silenciamiento de un sistema in vitro a las células de un paciente adulto.

Como eliminar uno de los tres cromosomas 21

Un equipo de investigadores de varias instituciones japonesas ha tratado de desarrollar un modelo in vitro para eliminar el cromosoma 21 supernumerario utilizando la técnica de edición genómica CRISPR-Cas9. Para ello utilizaron células madre pluripotentes inducidas (iPSC) procedentes de fibroblastos de la piel de un paciente con trisomía 21. La idea es tratar de actuar sobre un cromosoma determinado de los tres, para lo cual, y dada la forma de actuar de la tecnología de edición genómica, había que ejercer su acción sobre “alelos específicos” de ese cromosoma, sin afectar a los otros dos. Se trata de producir múltiples cortes en su ADN, que no fuesen reparados tras la acción de la enzima Cas9, para provocar su pérdida sin afectar a los otros dos cromosomas 21_[4].

La tecnología CRISPR-Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta para la edición del genoma. Mediante esta técnica se consigue con gran precisión la edición, mutación o eliminación de secuencias cortas específicas del ADN en lugares genómicos de secuencia conocida.

La acción de Cas9 genera el corte del ADN en ambas cadenas al mismo nivel (doublé strand breaks o DSB). En circunstancias normales, estos cortes tienden a ser reparados por los sistemas moleculares de reparación propios de las células eucariotas, pudiendo producirse una reparación homóloga (HEJ) o no homóloga (NHEJ). Estos mecanismos dependen de genes que sintetizan las enzimas polimerasas y ligasas de reparación, además de afectar a otros factores, tales como el estado de relajación de la cromatina y la etapa del ciclo celular.

Naturalmente, en caso de tratar de eliminar un cromosoma completo no interesa que se reparen los puntos de corte provocados por la acción de la Cas9, por lo que el grupo de investigación utilizó un método de interferencia de la acción de los genes implicados en la reparación (ARN antisentido) para anular su actividad. Al suprimir la reparación, tras la escisión por múltiples lugares del cromosoma diana, se elevaría la frecuencia de eliminación del cromosoma elegido como diana.

La impronta parental

Un factor que tuvieron en cuenta fue la existencia de la “impronta parental”, un fenómeno por el cual los cromosomas de origen materno o paterno, aunque contengan la misma dotación génica, incorporan marcas diferenciales de carácter epigenético en diversos puntos.

De los tres cromosomas 21 presentes en las personas con síndrome de Down, dos proceden de un parental por un error en la disyunción de la primera división celular de la meiosis que precede la gametogénesis. El otro procede del otro parental. La mayoría de los casos de síndrome de Down por trisomía 21 se debe a la no disyunción durante la primera división meiótica de la ovogénesis, de modo que es el óvulo materno el que transmite dos cromosomas 21 en lugar de uno. En consecuencia, dado que la no disyunción es posterior a la recombinación de los cromosomas homólogos en la meiosis femenina, tras la fecundación las tres copias del cromosoma 21 son genéticamente distintas (mismo contenido de genes pero con variabilidad alélica), a lo que se suma la diferente impronta de acuerdo con su procedencia paterna o materna.

Por ello, si se desea eliminar uno de los tres cromosomas, las diferencias de impronta ofrecen la ventaja de poder desarrollar sistemas CRISPR-Cas9 específicos para apuntar solo a uno de los cromosomas. Así, en el cromosoma 21 paterno hay un pequeño subconjunto de genes improntados, cuya expresión queda condicionada frente a los alelos del cromosoma o cromosomas maternos.

Entre estos genes están, los que codifican una molécula de adhesión celular, la superóxido dismutasa tipo 1, la proteína ribosómica mitocondrial L39, y otros, que por la impronta parental quedan silenciados respecto a sus homólogos procedentes de la gametogénesis femenina. Estos genes u otros serían útiles para su reconocimiento y para la eliminación específica del cromosoma que los contiene tras la acción del sistema CRISPR-Cas9, sin alterar a los otros dos.

El método para reducir a dos los ejemplares del cromosoma 21 sería identificar múltiples secuencias específicas de uno de los tres cromosomas y dirigir contra ellas la actividad CRISPR-Cas9. La tecnología CRISPR-Cas9 por medio de ARN guía específicos dirigida a medio centenar de regiones repartidas a lo largo del cromosoma elegido provocaría su ruptura por medio de la enzima Cas-9. Tras su acción, el cromosoma diana quedaría troceado y en condiciones de no ser reparado, quedando intacta la estructura y estabilidad funcional de los otros dos cromosomas, que serían los únicos que pasarían a las células hijas.

El experimento en el laboratorio

Los autores realizaron este trabajo in vitro. Para ello, desarrollaron varias líneas celulares pluripotentes inducidas (iPSC) procedentes de fibroblastos de un paciente con trisomía 21. En su diseño experimental crearon líneas iPSC trisómicas con diferentes combinaciones de genes improntados y eligieron uno de los cromosomas como portador de las dianas de la enzima Cas9 para su eliminación. Los resultados obtenidos fueron prometedores, tanto en lo que respecta a la eliminación del cromosoma 21 elegido, como por no observarse aberraciones cromosómicas estructurales notables tras aplicar técnicas citogenéticas de bandeo y fluorescencia para la observación cariotípica.

Además, comparando mediante análisis estadísticos las células originales con la trisomía 21, con los clones celulares rescatados euploides, es decir, con la dotación de cromosomas corregida, estos se asociaban con un mejoramiento fenotípico en componentes como el desarrollo del sistema nervioso central humano y la neurogénesis. Esto sugiere que la pérdida del cromosoma 21 se asocia significativamente con los genes expresados en el sistema nervioso durante el desarrollo.

También se evaluaron las tasas de proliferación celular y la función mitocondrial relacionadas con la muerte celular, quedando patente un ligero aumento en la tasa de proliferación, una mejoría en la función mitocondrial y un tiempo de duplicación notablemente más corto en las células disómicas obtenidas tras la eliminación de un cromosoma 21, respecto de las trisómicas.

El análisis se completó aplicando el modelo directamente sobre células diferenciadas, fibroblastos, lo que es importante para comprender el potencial clínico de esta técnica. Se comprobó su validez para eliminar el cromosoma 21 diana en fibroblastos primarios de la piel, aunque con menor efectividad.

La conclusión es que el rendimiento de esta tecnología es bajo respecto a lo deseado para una tecnología que se proyecta con fines de aplicación clínica.

Posibilidades clínicas futuras de estas investigaciones

Tanto la técnica del silenciamiento de un cromosoma 21 utilizando la terapia génica del sistema Xist, como la edición del cromosoma utilizando CRISPR/CAS9 para eliminar el cromosoma 21 extra, son pasos iniciales de una extraordinaria complejidad técnica y resultados parcialmente prometedores y en su caso aplicables solo en embriones preimplantatorios, con todos los riesgos inherentes a la modificación genética en embriones.

La esperanza de mejorar reversiblemente la aptitud celular y las características fenotípicas del síndrome de Down se mantiene, aunque las dificultades son enormes.

Valoración bioética

La aplicación de la edición genética con el fin de silenciar unos cuantos genes o una multitud de ellos en experimentos de laboratorio, con resultados ciertamente esperanzadores, abre perspectivas para intervenciones clínicas futuras que pudieran reducir o incluso eliminar las manifestaciones fenotípicas limitantes asociadas a la trisomía 21.

Pero debe insistirse que modificar genéticamente células en el laboratorio es algo manifiestamente distinto de tratar de hacerlo in vivo, es decir, sobre un cigoto, de modo que estas alteraciones pudieran trasladarse a la totalidad de las células del individuo.

La primera dificultad estriba en la imposibilidad de realizar el diagnóstico genético que permitiera confirmar la existencia de la trisomía en el embrión unicelular, el cigoto. Para ello, se debería esperar hasta que este incipiente embrión posea al menos 6-8 células, lo que dificultaría que las modificaciones introducidas afecten a todas ellas para extenderse posteriormente a todos los linajes celulares del organismo.

Aún existe otra dificultad en el horizonte de aplicación de estos avances que se ha mencionado ya. Actuar sobre determinados genes codificadores de proteínas relacionados con la manifestación fenotípica del síndrome, provoca otros efectos no deseados (off-target) sobre una multitud de genes cuya expresión está relacionada. El alcance de estas modificaciones en cadena es hoy impredecible. Y pensar que estos efectos incontrolados acabarían extendiéndose a los billones de células del individuo plantea un escenario difícil de imaginar.

Pero deben alentarse los esfuerzos que, como los expuestos en este artículo, tratan de corregir las anomalías genéticas que se sitúan en el origen del síndrome de Down, con la esperanza -tal era el sueño de su descubridor Jérôme Lejeune- de que algún día se logrará superar las limitaciones que los afectados sufren en su desarrollo y su salud.

Esta es la alternativa bioéticamente plausible, que se sitúa en las antípodas de la actualmente generalizada eugenesia, que condena a la inmensa mayoría de las personas con síndrome de Down no nacidas a una muerte segura víctimas del aborto.

Mientras se avanza en estas nuevas posibilidades clínicas, se puede seguir haciendo mucho, y ahora, para mejorar la vida de los afectados por el síndrome, y se puede también recibir mucho de ellos, porque en nada decrece su humanidad, su ternura y su dignidad.

    

Nicolás Jouve
Catedrático Emérito de Genética de la Universidad de Alcalá
Ex miembro del Comité de Bioética de España
Miembro del Observatorio de Bioética
Universidad Católica de Valencia